В 1371 году в грамоте литовского князя Ольгерда впервые упоминается городок, находящийся находился на северо-западной стороне острова Кличен. Городки в этих местах в течение долгого времени являлись предметом споров русских и литовских князей. В 1393 году Новгородская рать разорила и сожгла городок Кличен, жестоко расправившись с его жителями. Немногие уцелевшие перебрались на полуостров к югу от острова Кличен и поселились там.
Следующий раз селения, названные осташковскими слободками, упоминаются в 1477 году князем Борисом Васильевичем Волоцким. Слободки называются Евстафьевской и Тимофеевской, впоследствии первая из них получила имя Иосифовской, вторая - Митрополичьей или Патриаршей.
Вид на озеро Селигер в Осташкове
Известно, что в XVI веке на острове Столбный в 10 км к северу от Осташкова жил монах-отшельник Нил, впоследствии причисленный к лику святых. Впоследствии на острове Столбном был основан монастырь Нилова Пустынь, который позже стал одним из самых богатых и посещаемых в России.
В 1587 году Осташковские слободки из-за опасности литовского нашествия обносятся крепостной стеной. Однако укрепления не спасают городок от завоевателей, и в последующие два года он несколько раз переходил из рук в руки. 1610 году Осташков был окончательно освобожден от интервентов. Из-за возможности нового литовского нашествия вокруг Осташкова в спешке возводятся новые крепостные сооружения. Жителям разоренного войной города помогали присланные жители Зубцова и Ржева.
В 1651-1653 гг. по указу царя Алексея Михайловича в пограничном Осташкове началось строительство новой укрепленной крепости. Вокруг всего города возводится самая высокая за его историю бревенчатая крепостная стена. Население Осташкова в это время - около 250 человек. Однако в результате сильного пожара 1676 года сгорели крепостные стены и башни города, много дворов и церкви.
После ходатайства новгородского генерал-губернатора графа Якова Ефимовича Сиверса указом Екатерины II (1767 год) Осташков получил статус города. С 1784 года началось строительство Осташкова по новому генеральному плану. К этому времени население города - 6393 человека; каменных домов - 3; церквей 3: Соборная, Воскресенская, Преображенская и Знаменский девичий монастырь; 76 кузниц; три завода красной и черной юфти, 26 кожевенных и 6 сыромятных заводов.
Жилые дома 1-й половины XIX века
В 1812 году жители Осташкова собрали 20 тысяч рублей для формирования земского войска для борьбы с нашествием Наполеона.
В 60-х гг. XIX века открываются земские учреждения, мировые и общие судебные учреждения. В 1889 году при осташковском городском училище был создан музей.
24 октября 1904 года на станцию Осташков Бологое-Полоцкой железной дороги прибыл первый поезд. В 1907 году было открыто регулярного движения по железной дороге Бологое-Полоцк.
В Феврале 1918 года в Осташкове произошло антибольшевистские выступления. 6 июля 1918 года в Осташкове произошло новое антибольшевистское восстание, в ходе которого был убит первый осташковский военный комиссар Орловский.
При советской власти монастырь Нилова Пустынь был переоборудован в концлагерь для польских военнопленных. Весной 1940 г., большинство их было расстреляно в здании внутренней тюрьмы НКВД в Калинине.
Осенью 1941 года линия фронта приблизилась к Осташкову на 4-5 километров. Осташков становится прифронтовым городом. Немецкая авиация часто бомбила город - преимущественно железнодорожную станцию и городскую электростанцию, реже - жилые кварталы.
После войны из оккупированной Германии в Советский Союз была направлена большая группа немецких специалистов-ракетчиков, которые жили на острове Городомля вблизи Осташкова. Там они помогали советским специалистам в разработке ракетной техники. В 1951-53 гг. немецких специалистов отпустили назад в Германию.
С середины 1960-х годов в Осташкове началось современное жилищное строительство. Возводится жилищный комплекс из пятиэтажных зданий, строится ряд пятиэтажек в черте старого города.
Летом 1988 года в Осташкове прошел первый фестиваль "Музыкальное лето Селигера". Впоследствии он стал ежегодным.
В Осташкове развивается кожевенная и пищевая промышленность.
В городе имеется краеведческий музей. Сохранились памятники архитектуры XVII в., классицистические постройки конца XVIII - начала XIX вв. Близ Осташкова - Музей природы Селигерского края.